Drahý mikrób

Share Tweet Pin it

Vzhľadom k tomu, doba Pasteur je dobre známe, že v ľudskom gastrointestinálnom trakte, je v podstate typu bioreaktora tok, v ktorom množstvo mikroorganizmov obývajú. Postoj vedcov k črevnej mikroflóre počas tejto doby sa radikálne zmenil. Pred sto rokmi, veľký Ilya Mechnikova, zakladateľ modernej teórie imunity, pre vytvorenie ktorého on prijal Nobelovu cenu (pre dve osoby s jeho nezmieriteľného súpera, nie menej ako veľký Paul Ehrlich), dokonca navrhoval odstránenie hrubého čreva ako spôsob, ako predĺžiť život. A tých, ktorým toto opatrenie javí ako príliš radikálny, odporúča vypiť veľké množstvo jogurtu vytesniť škodlivý, podľa jeho názoru, mikróby prospešné laktobacily. Za pol storočia sa kurz zmenil o 180 stupňov. Ukázalo sa, že normálnej črevnej mikroflóry, rovnako ako kože a slizníc, vykonávať mnoho užitočných funkcií - napríklad potlačiť vitálne funkcie organizmu neustále útočia na patogény. A v posledných rokoch, najodvážnejší z mikrobiológov išli ešte ďalej tým, že vyhlási osobe a jeho symbiotické mikróbov single superorganism.

Vývoj metód molekulárnej biológie viedol vedcov k novej úrovni pochopenia procesov symbiózy človeka a jeho mikroflóry, ktoré sa zdali dobre študované a zo štúdia, o ktorom neočakávali zvláštne prekvapenia. Rýchly rast a pokles nákladov na metódy sekvencovania DNA (stanovenie jeho nukleotidovej sekvencie) a paralelné zvýšenie výkonu osobných počítačov a rozvoj internetu bolo možné analyzovať informácie o veľkých oblastí genómu. Po chromozóme boli sto jednotlivé druhy baktérií transkribovaných v novom prístupe mikrobiálnej genetiky - počet obyvateľov: analýza génov naraz všetky baktérie obývať konkrétnu lokalitu. Samozrejme, populácia "ľudského bioreaktora" sa ukázala byť jedným z najdôležitejších pre štúdium mikrobiálnej populácie.

Prvá práca, ktorá priniesla nový pohľad na črevnú mikroflóru, vyšla v roku 1999 skupina vedcov z Národného inštitútu pre výskum poľnohospodárstva (Francúzsko) a University of Reading (Veľká Británia). Autori sa rozhodli použiť metódu sekvenovania 16S RNA génov na štúdium populácie mikrobiálneho čreva.

16S RNA - identifikácia baktérií

Od čias Pasteur prvý a nevyhnutný krok pri stanovení mikroorganizmov bol ich pestovanie na živnom médiu. Ale mnoho dôležitých (a užitočných a patogénnych) mikróbov nechce rásť na žiadnom z médií. Študijné skôr nedostupné nekultivovatelná baktérie a začnú vyčistiť úplne mätúce taxonómiu známych prokaryot bolo možné s rozvojom bioinformatiky a príchodom moderných techník molekulárnej biológie - polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá umožňuje z jedného kusu DNA získať milióny a miliardy presné kópie, klon izolovaný z PCR génov do bakteriálnych plazmidov a nukleotidových sekvenčných metód, výsledný to všetko v dostatočnej pre ana Vyššie Iza.

Ideálne marker pre identifikáciu mikroorganizmov ukázali génu kódujúceho 16S ribozomálnej RNA (každé z dvoch ribozomálnej podjednotky - dielne bunkovú proteosyntézu - pozostáva z prekladaných reťazcov molekúl proteínov a ribonukleovej kyseliny).

Tento gén je v genóme všetkých známych baktérií a Archaea, ale chýba v eukaryoty a vírusy, a ak sa nájsť jeho charakteristickú sekvenciu nukleotidov, - sú si istí, že čo do činenia s génmi z prokaryot. (To je veľmi presný, gén 16S RNA a tam pri eukaryoty, ale nie v jadrových chromozómov a mitochondriálnej To opäť potvrdzuje, že mitochondrie -. Vzdialení potomkovia symbiotické baktérie prvých eukaryotických organizmov.)

Tento gén má konzervatívne miesta, rovnaké pre všetky prokaryoty a druhovo špecifické. Konzervatívny výkresy sú pre prvý stupeň polymerázovej reťazovej reakcie - pridanie cieľovej DNA s primermi (osiva DNA úseky, na ktoré študoval Nukleotidová reťazca by sa mali pripojiť k spusteniu analyzovať zvyšok sekvencie) a druhovo špecifických - pre identifikáciu druhu. Okrem toho stupeň podobnosti druhov špecifických lokalít veľmi dobre odráža vývojové vzťahy rôznych druhov.

Dodatočný bonus - pre klonovanie a následnú analýzu môžete použiť samotnú ribozomálnu RNA, ktorá je v každej bunke prítomná v oveľa väčšom množstve ako zodpovedajúci gén. Len to musíme najprv "prepísať" do DNA pomocou špeciálneho enzýmu - reverznej transkriptázy.

Nukleotidové sekvencie 16S RNA všetkých známych baktérií a archaea (asi 10 000 druhov) sú všeobecne dostupné. Identifikované sekvencie sa porovnávajú s tými, ktoré sa nachádzajú v databázach a presne identifikujú druhy baktérie alebo deklarujú, že patria k ďalším nekultivovaným druhom.

V poslednej dobe došlo k intenzívnej revízii starých, fenotypových klasifikácií baktérií založených na zle formalizovaných kritériách - od výskytu kolónií po potravinové preferencie a schopnosť farbiť rôznymi farbivami. Nová systematika je založená na molekulárnych kritériách (16S RNA) a iba čiastočne sa opakuje fenotypová.

Kódujúce sekvencie 16S RNA PCR bol získaný priamo z "prostredia" - 125 miligramov človeka, bohužiaľ, stolice, bol vložený do plazmidu E. coli (nie preto, že črevné, a preto, že je Escherichia coli - jedna z molekulárnych biológov obľúbený Workhorse ) a opäť izolované z kultúry násobených baktérií. Preto bola vytvorená knižnica 16S RNA génov pre všetky mikroorganizmy vo vzorke. Potom bolo 284 klonov náhodne vybraných a sekvenovaných. Ukázalo sa, že len 24% výsledných 16S RNA sekvencií patrilo k predtým známym mikroorganizmom. Tri štvrtiny mikroflóry sa nachádza v črevách každého človeka, viac ako sto rokov sa vyhnúť pozornosti výskumníkov, vyzbrojený metódami klasickej mikrobiológie! Vedci jednoducho nemohol nájsť podmienky pre pestovanie týchto baktérií, pretože väčšina obyvateľov náladový čriev odmietla vystúpiť na tradičné mikrobiálne prostredie.

K dnešnému dňu, používajúci molekulárnej techniky zistené, že dospelý človek mikroflóry prezentované 10 z 70 hlavných bakteriálnych taxónov. Asi 90% našich mikróbov patrí k typu Firmicutes (sem patrí napríklad slávny laktobacily - hlavné "vinníkov" okysleniu mlieka) a Bacteroidetes - obligátne anaeróbne baktérie (organizmy, ktoré môžu žiť len v neprítomnosti kyslíka), ktoré sú často používané ako ukazovateľ znečistenia prírodné kanalizácie. Zvyšných 10% populácie rozdelené medzi taxónov Proteobacteria (medzi ne patrí, okrem iného, ​​E. coli), Actinobacteria (od jedného z druhov, aktinomycét antibiotickej streptomycín bol izolovaný), Fusobacteria (normálny obyvateľov ústnej dutiny a často spôsobujú periodontitis), verrucomicrobia (v poslednej dobe v geotermálny prameň bol objavený vo forme mikróbov, ktoré sa živia metánom, ktoré oplývajú v čreve kvôli iným mikroorganizmom), sinice (stále sú často označované ako starý názov "modrozelené riasy»), Spirochaeates (pre Wait Tew, nie bledý), Synergistes a VadinBE97 (aký druh zvierat, spýtajte sa tvorcovia nové taxonómiu prokaryotes).

Napriek skutočnosti, že druhové zloženie črevných mikroorganizmov je pomerne monotónne, kvantitatívny pomer zástupcov určitých systematických skupín v mikrobiológii rôznych ľudí sa môže veľmi líšiť. Ale čo je normálna črevná mikroflóra a aké sú spôsoby jej vzniku?

Na túto otázku odpovedal v práci skupiny amerických biológov, ktorú viedol Patrick Brown zo Stanfordskej univerzity v roku 2007. V priebehu prvého roka života vysledovali vznik 14 mikróbov u 14 novorodencov. Autori sa podarilo vytvoriť niekoľko zdrojov kolonizácie gastrointestinálneho traktu. Mikroflóra detí bola podobná materským mikroflórom: vaginálne, fekálne alebo mikroflóra materského mlieka. V závislosti od zdrojov kolonizácie v mikroflóre čriev dojčiat počas prvého roka života prevažovali rôzne druhy. Tieto rozdiely zostali počas celej štúdie významné, ale vo veku jedného roka sa prejavili znaky tvorby dospelých mikrobiálnych látok. Zaujímavé údaje boli získané s použitím dvojice dvojčiat. Ich mikroflóra bola prakticky rovnaká v zložení a menila sa rovnakým spôsobom. Toto zistenie odhalilo obrovskú úlohu ľudskej zložky hostiteľskej mikrobiálnej dvojice pri tvorbe populácie črevnej mikroflóry. Pre čistotu experimentu by sme samozrejme mali oddeliť deti späť v nemocnici - skvelý príbeh pre indický film! O niekoľko rokov neskôr sa navzájom poznajú analýzou... Ale iné štúdie potvrdili predpoklad, že individuálne, vrátane hereditárne podmienených vlastností ľudskej biochémie majú veľký vplyv na zloženie svojej mikroflóry.

Mikrobiálne v nás viac ako ľudské

Okrem štúdia niektorých druhov črevnej mikroflóry, v posledných rokoch, mnohí bádatelia študujú bakteriálne metagenom - sadu génov všetkých organizmov vo vzorke s obsahom ľudského čreva (alebo sčervenanie kože, alebo vo vzorke bahna z morského dna). Pre tento účel, najviac automatizované, počítačové a vysoko výkonné sekvenovanie DNA technológie, ktoré umožňujú analýzu krátke nukleotidové sekvencie, zbierať puzzle niekoľko nesúhlasné "písmen" na koncoch týchto častí, roztrúsená Opakujte tento postup pre každý kus genómu a prijímať dekódovanie jednotlivých génov a chromozómov rýchlosťou až 14 miliónov nukleotidov za hodinu - rádovo rýchlejšie, ako to bolo len pred niekoľkými rokmi. Tak bolo zistené, že ľudské črevnej mikroflóry má približne 100 bakteriálnych buniek trillionov - asi 10 krát väčšie, než je celkový počet master buniek v tele. Sada génov, ktoré sú súčasťou bakteriálne metagenomu, približne 100-krát množina génov ľudského tela. Pokiaľ budeme hovoriť o množstve biochemických reakcií prebiehajúcich v rámci mikrobiálnej populácie, znova ju mnohonásobne vyššia ako u ľudského tela. Bakteriálna "reaktor" sa vykonáva v hostiteľskom metabolického reťazca, ktorý, ktorý nie je schopný sa sám podporovať - ​​napríklad syntéza vitamínov a ich prekurzory, rozklad niektorých toxínov, rozklad celulózy na polysacharidov (u prežúvavcov), atď.

Štúdie realizované v laboratóriu Jeffrey Gordon (School of Medicine na Washington University, St. Louis, MO), nadviaže druhovú diverzitu baktérií tráviaceho traktu s diétou a vlastností konkrétneho metabolizmu. Výsledky experimentu boli zverejnené v decembrovom čísle prírody v roku 2006. Ročný experiment naznačoval vytvorenie korelácie medzi nadmernou hmotnosťou u človeka a zložením mikrobiálnej populácie jeho čriev. Tucet tukov, ktoré súhlasili s umiestnením brucha na oltár vedy, bolo rozdelené do dvoch skupín. Jedna dedina s nízkym obsahom tuku, druhá s nízkym obsahom sacharidov. Všetky dobrovoľníkov schudol, a zároveň sa zmenili pomer dvoch hlavných skupín črevných mikroorganizmov: počet buniek Firmicutes znížili, zatiaľ čo počet Bacteroidetes, naopak zvyšuje. Na tuku diétu s nízkym obsahom takáto zmena sa stala prominentnej neskôr - po tom, čo pacient stratil 6% hmotnosti a s nízkym obsahom sacharidov - potom, čo prehral prvý kg (2% počiatočnej telesnej hmotnosti). Súčasne bola zmena zloženia mikroflóry ešte výraznejšia, tým menšia bola váha účastníkov experimentu.

Súčasne v rovnakej laboratórnych experimentoch boli vykonané na laboratórnych myší nesúcich mutáciu v géne pre leptín - "sýtosti hormónu" proteínu, ktorý je syntetizovaný v tkanivových buniek tukových, a dá jeho príspevok k tvorbe sýtosti. Myši, v ktorých obe kópie poškodeného génu (táto mutácia je označené indexom Lep ob), jesť 70% viac ako divokého typu, so všetkými vyplývajúcimi dôsledkami. Obsah Firmicutes v črevách a pol krát vyššia, než je z heterozygotných liniek, len s jedným defektné alely (ob / +) a homozygotné pre normálne gén kmeňov divokého typu (+ / +).

Vplyv mikroflóry na metabolizmus svojho "hostiteľa" výskumní pracovníci testovali na inom modeli - gnotobiotických myšiach.

Taká zvieratá, od narodenia žijúci v sterilných komôr, a nikdy v živote stretol jediného mikróba používané v biomedicínskom výskume je príliš často. Absolútna sterility myshatnike, Rabbitry a najmä kozie stodola - nákladná a náročná, a po stretnutí s prvým mikrób alebo vírus alebo zlý zomrie alebo sa stane nevhodné pre ďalšie experimenty. Čo sa deje v gnotobiote s imunitným systémom - je iný príbeh, a jedia za tri a zároveň - koža a kosti v dôsledku nedostatku mikrobiálneho vyhnívania zložky.

Po transplantácii mikroflóry z obéznych (ob / ob) darcov boli gnotobiotické myši skoro 50% vykrmované počas dvoch týždňov (o 47%). Tí, ktorí boli "osiení" mikroflórom od darcov divokého typu (+ / +) s normálnou hmotnosťou, sa uzdravili len o 27%.

Výsledky ďalších štúdií zmien symbiotického myšacieho mikrobiálneho organizmu skvelo potvrdili hypotézu, že mikrobiálna toxicita obéznych jedincov prispieva k hlbšiemu spracovaniu potravy. Porovnanie vzoriek DNA stolice obéznych a normálnych myší ukázalo, že myši obéznych myší sú nasýtené enzýmovými génmi, ktoré umožňujú účinnejší rozklad polysacharidov. Črevo obéznych myší obsahovalo veľké množstvá konečných fermentačných produktov - zlúčeniny kyseliny octovej a kyseliny maslovej, čo naznačovalo hlbšie spracovanie potravinových zložiek. Kalorimetrická analýza (zo slova "kalórie"). Analýza vzoriek stolice potvrdila toto: ob / ob myšiaci stolička obsahovala menej kalórií ako myši divokého typu, ktoré úplne neabsorbovali energiu z potravy.

Okrem dôležitých informácií o "zárodočné" zložky obezity, autori boli schopní preukázať podstatnú podobnosť medzi mikroflóry obéznych ľudí a myší, čo otvára nové možnosti pri štúdiu problému nadváhy a snáď - a vyriešiť tento problém tým, že "prevodu" zdravej mikroflóry alebo jej tvorby u pacientov, trpiacich obezitou.

Skutočnosť, že mikroflóra môže spravovať hostiteľa metabolizmus už nie je pochýb. Štúdia Gordon laboratórium zameraná na problém nadmernej hmotnosti bolo možné preklenúť medzeru na liečbu metabolických ochorení, ako je napríklad kachexia, postihuje deti od jedného roka do štyroch rokov v chudobných tropických krajinách - marazmus (na idiotství, že slovo má iba jazykovo: gréckej marasmos. doslovne znamená vyčerpávanie, zánik) a kwashiorkor (v jazyku jedného z kmeňov Ghane kwashiorkor - "Red boy"). Výskyt ochorení spojených s nedostatkom bielkovín a vitamínov v prechode z dojčenia na dospelých potravín. Ale choroba selektívne ovplyvní deti, ktorých bratia a sestry nezaznamenali žiadne problémy s prechodom k tradičnému jedálničku tohto regiónu. Štúdie preukázali, že črevná mikroflóra chorých detí je veľmi odlišný od mikroflóry svojich rodičov, rovnako ako mikroflóry zdravých súrodencov. V prvom rade si všimol takmer úplná absencia črevnej populácií Bacteroidetes a ovládnutie vzácnych druhov, ktoré patria k typom Proteobacteria a Fusobacteria. Po choré deti (pozor, aby sa predávkovanie!) Vykrmovaniu hard-proteín potraviny, ich mikroflóry stáva podobný normálne, ako sú príbuzní, s prevahou Bacteroidetes a Firmicutes.

Nedávne štúdie nielen radikálne zmenila prevládajúce predstavy o ľudskej črevnej mikroflóry, ale tiež prispel k vzniku konceptu, ktorý považuje črevnej mikroflóry ako ďalšie mnohobuněčného "orgán" v ľudskom tele. Orgán pozostávajúci z rôznych bunkových línií schopných komunikovať medzi sebou, ako aj s hostiteľským organizmom. Orgán, ktorý prerozdeľuje toky energie, vykonáva dôležité fyziologické reakcie, zmeny pod vplyvom životného prostredia a sám sa obnovuje so zmenami spôsobenými vonkajšími podmienkami.

Pokračoval výskum "bakteriálna telo" môže a mala by viesť k pochopeniu zákonov jeho fungovanie, zverejňovanie jeho delikátnych vzťahov s hostiteľom a v dôsledku toho, že sa objavujú nové metódy boja proti ľudskej choroby cielenú liečbu dysfunkcií oboch metaorganizma zložiek.

Valery Poroiko, Ph.D.
Univerzita v Chicagu, oddelenie všeobecnej chirurgie
Portál «Večné mládež» www.vechnayamolodost.ru

Časopisová verzia článku sa uverejňuje v publikácii "Popular Mechanics" č. 4-2008

identifikácia druhov sekvencovanie bakteriálne ribozomálnej RNA 16S génu, role a miesto metódou v diagnostike bakteriálnych infekcií splnené: Saveliev. - prezentácia

Prezentáciu vydala pred 4 rokmi Ľudmila Šúmíhina

Súvisiace prezentácie

Prezentácia 11. triedy na tému: "Špecifická identifikácia baktérií metódou sekvenovania génu 16S ribozomálnej RNA, úloha a miesto metódy pri diagnostike bakteriálnych infekcií. Ukončená: Savelyeva". Stiahnite si zadarmo a bez registrácie. - Prepis:

1 druh identifikácie baktérií sekvencovania génu 16S ribozomálnej RNA, role a miesto metódou v diagnostike bakteriálnych infekcií splnené: Saveliev Xenia splnené: Saveliev Xenia, žiak 11 špecializovaná trieda žiak 11 špecializovaná trieda MBOU Krasnoobsk SOSh 1 MBOU Krasnoobsk SOSh 1 Školiteľ: Vedúci : Cand. Biol. Vedy Afonyushkin Vasily Nikolaevich Cand. Biol. Vědy Afonyushkin Vasily Nikolaevich

2 Ciele: 1. zvládnuť elektroforéza DNA na agarózovom géli 2 Ak chcete získať metódu pre analýzu výsledkov sekvencovania, a vykonať výstavbu nukleotidových sekvencií, génových fragmentov 16 S ribozomálnej RNA izolátov získaná majstra rodu Bacillus 1. DNA elektroforézou na agarózovom géli 2 Ak chcete získať metódu pre analýzu výsledkov sekvencovanie a vykonať výstavbu nukleotidových sekvencií, génovej fragmenty 16 s ribozomálnej RNA izolátov získaných rod Bacillus 3. vykoná zdieľanie sekvenčných techník pre biochémiu a perspektívu identifikácia cal baktérií 3. študovať vyhliadky na zdieľanie metódy sekvenovania, a biochemické identifikácia baktérií Cieľ: Pre štúdium možnosti spôsobu špecifické identifikáciu baktérií sekvencovanie 16S ribozomálnej RNA v spojení s tradičnými metódami identifikácie

3 materiály a metódy Čisté kultúry izoláty boli nanesené na MPA hodín a po inkubácii sa bakteriálne suspenzie bola pripravená vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku. Kultúry boli farbené Gramom a mikroskopicky. Hodnotené na základe biochemických vlastností: Odstránenie citrát, MALONE, glukóza, laktóza, manitol, sacharóza, inositol, sorbitol, arabinózy, maltóza, fenylalanínu, tvorba indolu, sírovodík, atsetilmetilkarabinola (reakcia Foges- Proskauerův), prítomnosť beta-galaktozidázy, ureázy, arginín dekarboxylázy a lyzín, hydrolázy arginínu. Kultúry boli testované na katalázy, oxidázy cytochrómu, tvorbu dusitanov, syntézy pigmentu, rezistencie k antibiotikám, a študoval kultúry a morfologické vlastnosti. Beta-galaktozidázy a tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktivita bola testovaná na strednej Uriselekt 4 (BIORADE) DNA sa izoluje podľa zobrazeni fenolhloroformennym stanovená na základe sekvenovania 16S ribozomálnu gén RNAi fragmentu intergenové spaceru ribozomálnu RNA a 16-23S množstvo biochemické, kultúrnych a morfologické charakteristiky.

4 Kultúrne vlastnosti: pestované kultúry nekončili v prostredí Endo; netýkala enterobaktérií, pestovaných na agare mäso peptóny za aeróbnych podmienok pri teplote 37 ° C vyfarbovacie vlastnosti: kultúra pestuje skúmané mikroskopicky a gram-farbenie, ktorá umožnila stanoviť, že získaná kultúra sú spór Gy + palice Charakteristika kultúry

Schéma 5 Výskum: z pestovaných kultúr DNA bola izolovaná a umiestnená PCR s univerzálnymi primermi viesť amplifikovanej génový fragment 16S ribozomálnu RNA

6 so základným roztokom rozdelené do 4 skúmaviek, z ktorých každá sa štyroch deoxynukleotid dATP, dCTP, dTTP (jeden radioktivnym izotopom značené), a jeden zo štyroch 2; 3- dideoxynukleotidy (ddATR, ddTTR, ddGTP, dd MFR) dideoxynukleotidového to je obsiahnutá vo všetkých polohách rastúcich reťazcov zmesi, a po vstupe do rast reťazca je okamžite zastaviť. Výsledkom je, že v každej zo štyroch rúrok za účasti DNA polymerázy generovaný unikátny súbor olignukleotidov rôznych dĺžok obsahujúce praymerovuyu sekvencie. Ďalej skúmavky boli pridané do formalid divergencia reťazca a elektroforézou na géli polyakrylových cheteryh stôp. U nás Autorádiografické, vďaka ktorému je možné "čítať" sekvencovania nukleovej sekvenciu DNA segmentom. V biochémiu a molekulárnej biológie elektroforéze sa používa na oddelenie makromolekulárnej proteínov a nukleových kyselín (a ich fragmentov). Existuje veľa odrôd tejto metódy. Táto metóda nájde široké uplatnenie pre separáciu zmesí biomolekúl na frakcie alebo jednotlivých látok a používa sa v biochémie, molekulárnej biológie, Clinical Diagnostics, biológie populácie (pre štúdium genetickej variability) a dr.belkovnukleinovyh kyseliny elektroforézy tento elektrokinetické jav posunutie dispergovanej fázy (koloidné alebo proteín roztok) v kvapalnom alebo plynnom prostredí, pôsobením vonkajšieho elektrického polya.elektrokineticheskoe yavlenieelektricheskogo polyaElektroforez Schéma štúdie: PCR produkty boli separované elektroforézou na agarózovom géli. Sangerovu metódu

7 Výsledky vlastného výskumu Obr. 1 Výsledky kapilárnej elektroforézy fragmentu 16S génu ribozomálnej RNA

8 Obr. 2 fylogenetický strom vytvorený na základe výsledkov zarovnania fragmentu 16S génu ribozomálnej RNA

9 Výsledky vlastného výskumu Obr. 3 Výsledky porovnania nukleotidových sekvencií

10 Výsledky biochemické štúdie kultúr pomocou testu PBDE biochemické vlastnosti kmeňa B. licheniformis: negatívne využitie citrát, MALONE negatívne, citran sodný + glukóza negatívne negatívny negatívny lyzín, arginín, ornitín, fenylalanín negatívny negatívny, indol negatívne, ureázy pozitívne atsetilmetilkarabinol negatívne sulfid negatívne, pozitívne, glukóza, b-galaktozidázy pozitívne, negatívne laktóza, manitol pozitívne, pozitívne, sacharóza, inositol pozitívne sorbitolu pozitívne, maltóza pozitívne

11 Záver identifikácia druhov mikroorganizmov na základe sekvenovania môže byť "zlatý štandard" pre laboratórnej diagnostiky, ale presnosť metódy je obmedzená spoľahlivosť a úplnosť databázu GenBank a preto vyžaduje použitie iných potvrdzujúcich testov.

Analýza 16s RNA

Biotechnológia, 2005, №6, od 3-11

Spôsob pre identifikáciu mikroorganizmov, na základe analýzy polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP), PCR produkt génu RNA 16S dĺžke 1500 nukleotidov. 6 uzavreté sada restrikčná endonukleáza (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI a RsaI), pomocou RFLP umožňuje identifikáciu širokého spektra mikroorganizmov.
Štyri izoláty termolabilnej alkalickej fosfatázy boli izolované z izolátov prírodnej morskej vody. RFLP analýza vykonaná na týchto kmeňov v porovnaní s vypočítanými výsledkami získanými pre 16S RNA génu rôznych mikroorganizmov, bolo zistené, že identifikované výrobcovia patrí do rodu Alteromonas.

Spolu s tradičnými metódami identifikáciu mikroorganizmov pomocou kultúrnych a morfologické vlastnosti, ako aj chemické a biochemické reakcie [1], v poslednej dobe stále viac používaných metód na stanovenie mikroorganizmov sú založené na porovnaní nukleotidových sekvencií génov z rôznych mikroorganizmov [2-4] a dĺžka polymorfizmus analýza DNA reštrikčných fragmentov získaných amplifikáciu špecifických bakteriálnych génov [5,6]. Väčšina z nich sú vhodné pre identifikáciu génov kódujúcich 16S a 23S ribozomálnej RNA, pretože sú prítomné vo všetkých bunkách baktérií sú rodovo špecifické a pre väčšinu mikroorganizmov, [7-9]. Slúži na identifikáciu DNA fragment obsahujúci ako gény 16S a 23S RNA, a dištančné vložku, umiestnenú medzi nimi a sú variabilnejšie, umožňuje rozlíšenie medzi príbuzných druhov a poddruhov mikroorganizmov [10].

Tento dokument predstavuje výsledky RFLP analýzy PCR produktu 1500 nukleotidov pre rôzne mikroorganizmy, a ukázal, že použitie restrikčná endonukleáza 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI a možno spoľahlivo identifikovať väčšinu mikroorganizmov. Papier identifikované 4 novému výrobcovi termolabilné alkalickej fosfatázy a podľa navrhnutého spôsobu, porovnávaciu analýzu RFLP pre identifikáciu týchto mikroorganizmov. Na základe porovnania na základe dospela k záveru, že výrobcovia výsledky patrí do rodu Alteromonas.

EXPERIMENTÁLNE PODMIENKY

Pre detekciu produkuje tepelne alkalickej fosfatázy 50 l morskej vody sa rozotrie na živnom agarovom povrchu a analyzované, ako je popísané v [11]. Príprava mikrobiálnej biomasy bola vykonaná pestovaním produkovať pri teplote 20 ° C v živnej pôde, obsahujúci 1% tryptón (AGS GmbH, Nemecko), 0,5% kvasnicový extrakt (rovnakej spoločnosti) a slanú vodu mora (NaCl - 27,5, MgCI2 - 5, MgS044 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeS04 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Semienkový vývar bol rozdelený do 200 ml až 700 ml odmerných baniek a pretrepávaný pri 150 otáčkach za minútu počas 16 hodín.

Izolácia chromozomálnej DNA sa uskutočnila metódou [13].

Amplifikácia 16S génu ribozomálnej RNA sa uskutočnila polymerázovou reťazovou reakciou, ako je opísané v [14].

Reštrikčná reakcia amplifikovanej DNA sa uskutočnila 4 hodiny pri 37 ° C v 20 ul reakčnej zmesi obsahujúcej 2 ekv. akt. obmedzenia Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI alebo Rsal NPO "SibEnzyme", vo vhodnom pufri. Reakcia sa zastavila pridaním 5 ul zastavovacieho roztoku obsahujúceho 0,1 M EDTA, 0,05% brómfenolovej modrej a 40% sacharózy.

Elektroforetická separácia reštrikčných produkty amplifikovanej DNA bola vykonávaná v 2% agarózovom (Sigma) v Tris-acetátový pufri s Ethidium bromidom (0,5 mg / l) pri 120 V po dobu 4 hodín.

Na stanovenie dĺžky DNA fragmentov sa použili markery molekulovej hmotnosti DNA (100bp +1,5 Kb DNA markery, NGO "SibEnzim"). Dĺžka získaného obmedzenia sa určila pomocou počítačového programu Gel Pro Analyzer, verzia 4.0.00.001. Percentná identita dĺžky fragmentu sa vypočítala pre každú dvojicu mikroorganizmov porovnaním reštrikčných vzorov oddelene pre každý reštrikčný enzým. Pri porovnaní dĺžky obmedzenia sa odhadovali, že fragmenty DNA identické v dĺžke sa líšia najviac o 5%.

Na porovnanie experimentálnych údajov s publikovanými sekvenciami 16S RNA génov sa použila genetická databáza sekvenovaných sekvencií.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Štyri izoláty z kmeňa prírodnej výrobcu termolabilné fosfatáza boli izolované styku s morskou vodou, označené ako 20, 27, 48 a kmeň vyznačujúci skôr [11] za použitia obvyklých techník, ako je Alteromonas Undina. Na identifikáciu kmeňov získaných z biomasy mikroorganizmov pestovaných v kvapalnom živnom médiu s prídavkom morských solí sa izolovala chromozomálna DNA.
Ďalej, chromozomálnu DNA bola použitá v polymerázovej reťazovej reakcie k amplifikácii RNA gén 16S ribozomálnu. Amplifikačnej produkt spracuje nezávisle 6 rôznych restrikčná endonukleáza. Všetky sme použili Tetranukleotidové rozpoznávacie miesto pre restrikčné endonukleasu, ktorá umožňuje získať od 3 do 8 fragmentov DNA vyplývajúce zo štiepenia amplifikovaného produktu, o dĺžke asi 1500 bp. Reštrikčné enzým a používa Sse9I Tru9I sú v tomto poradí rozpoznávacie miesta AATT a TTAA kým reštrikčné enzýmy rezaných miest BsuRI a MspI z GGCC a CCGG. Restrikčné miesta pre rozpoznávanie enzým BstMBI a Rsal, respektíve GATC a GTAC, obsahuje vo svojom zložení všetkých štyroch nukleotidov. Takýto výber reštrikčné endonukleázy má podľa nášho názoru, poskytuje flexibilitu pri identifikácii mikroorganizmov, ktoré majú obe dodaním bohatý alebo GC-bohaté genómy. Z kvantitatívneho hľadiska je použitie iba šiestich rôznych obmedzení veríme optimálne, pretože použitie restrikčná endonukleáza 1 alebo 3, ako je navrhnuté v niekoľkých štúdiách [10,15] nemožno detekovať polymorfizmov k identifikácii blízko príbuzných organizmov, alebo, alternatívne, vedú k príliš veľké rozdiely Iz pre jednu alebo viac náhodných mutácií. Avšak, použitie 10 rôznych restrikčná endonukleáza nespôsobí ďalšie detekcie polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov DNA je jasne nadbytočný [9].
Obrázok 1 ukazuje, že simulovať pomocou obmedzenia počítač obrazu genov16S RNA, sme navrhli sadu šiestich reštrikčnými enzýmami (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI a RsaI). Gény 16S RNA sa odoberajú v genetickej banke sekvenovaných sekvencií. Výber mikroorganizmov bol pomerne náhodný. Všetky baktérie patria do rôznych rodov a predstavujú tak gramnegatívne, ako aj gram-pozitívne mikroorganizmy. Je zrejmé, že u všetkých mikroorganizmov existuje jedinečný vzor súboru restrikčných enzýmov. Počet fragmentov DNA sa pohybuje od 23 do 30 (dĺžka fragmentov menej ako 100 párov nukleotidov sa neberie do úvahy). Výsledky výpočtu percenta identity dĺžok fragmentov DNA (reštrikčné fragment považované za identické dĺžky sa líši o nie viac ako 5%) pre rôzne páry mikroorganizmov uvedených v tabuľke 1. Táto tabuľka ukazuje iba časť možných dvojíc mikroorganizmov, znázornených na obr. 1. Avšak, výsledky porovnania sú uvedené dostatočne odlišný a umožňujú vidieť, že percento identity dĺžok fragmentov DNA sa obvykle pohybuje v rozmedzí od 12-28% pre členov rôznych rodov mikroorganizmov. Tieto dáta teda ukazujú, že reštrikcie génov 16S RNA navrhnuté kontakt sada reštrikčných enzýmov môže slúžiť ako základ pre určenie generického si príslušenstvo bakteriálnych buniek.

Obr. 1. Teoreticky vypočítaná vzor elektroforetické separáciu 16S RNA génu amplifikačních produktov po ošetrení s reštrikčnými enzýmami Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) a RsaI (6). Stopy M - značka molekulovej hmotnosti

Hodnota 16S RNA v taxonomii. Molekulárna hybridizácia 16S RNA.

Molekulárna hybridizácia 16S rRNA. Prokaryotický ribozóm pozostáva z 3 podjednotiek, veľkých (23S), (5S) a (16S). Gene 16S rRNA má nasledujúce vlastnosti, dôležité vo fylogenéze:

1. RNA Ribozómy sú univerzálne pre rôzne druhy, ako samotné ribozómy. 2. Molekula 16S rRNA je konzervatívna a najmenej podlieha zmenám v priebehu biologickej evolúcie. Rýchlosť zmeny 16S rRNA génu v rôznych symbiotických baktériách bola 2-4% nukleotidových substitúcií v priebehu 60 my.3. Gene 16S rRNA má obidve ultrakonzervatívne a variabilné domény (domény), čo umožňuje vyhodnotiť vzdialené a blízke súvisiace vzťahy.4. Okrem toho Navyše sa zistilo, že cystróny rRNA sa nezúčastňujú na procesoch genetického prenosu medzi druhmi.5. Veľkosť gén (v prokaryotes je dlhý približne 1550-1640 bp) je optimálny z hľadiska zníženia štatistických chýb. Plná sekvencia sa môže stanoviť v jednom sekvenovaní pomocou metódy Sanger.Porovnanie katalógov nukleotidov. Metóda bola použitá na začiatku 80. rokov a mala veľký historický význam pri systematizácii baktérií. V tomto prípade bola molekula RNA (16S rRNA) ošetrená ribonukleázou T, ktorá štiepi molekulu nad rezíduami guanínu. Veľkosť získaných fragmentov bola maximálne 20 nukleotidov. Výsledné oligonukleotidy boli oddelené 2-merovou elektroforézou, sekvenované a vytvorili katalóg špecificky charakterizujúci molekulu rRNA. Pri porovnávaní katalógov sa brali do úvahy fragmenty s dĺžkou najmenej 6 nukleotidov. Použitím podobnostných koeficientov medzi katalógmi bol najskôr vytvorený všeobecný phylogenetický strom pre prokaryotov. Riboprinting. Metóda je založená na reštrikčnej analýze rRNA génov. Za týmto účelom izolujte celú DNA z bunky. Uskutočnili sa dva priméry homológne s vysoko konzervovanými hraničnými oblasťami 16S rRNA (malá podjednotka -s rDNA) génu a uskutočnila sa PCR. Fragmenty sú ošetrené niekoľkými restrikčnými endonukleázami a restrikčné produkty pre každú z endonukleáz sú oddelené v agarózovom géli spolu s profilom veľkosti DNA. Polymorfizmus dĺžok fragmentov vzniká v dôsledku skutočnosti, že niektoré z reštrikčných miest spadajú do konzervatívnych domén génu a niektoré do variabilných domén. Súčasne budú niektoré fragmenty bežné pre všetky druhy vo vzorke. Podľa počtu bežných a rozdielnych fragmentov je možné vypočítať genetickú vzdialenosť medzi druhmi. Použitie 12 reštrikčných enzýmov s rozpoznávacimi miestami dlhými 4 nukleotidy umožňuje pokryť 10-15% dĺžky génu 16S rRNA analýzou bez použitia sekvencie.

Drahý mikrób

Valery Poroiko,
Ph.D., University of Chicago, Oddelenie všeobecnej chirurgie
Populárna mechanika № 4, 2008

Len pred sto rokmi boli mikróby žijúce v ľudskom čreve považované za freeloaders a škodcov. V posledných rokoch bola ľudská mikroflóra nazývaná ako orgán nášho tela, potrebný pre normálny život tela.

Vzhľadom k tomu, doba Pasteur známe, že v gastrointestinálnom trakte človeka - to je v podstate typu bioreaktora tok, v ktorom množstvo mikroorganizmov obývajú. Postoj vedcov k črevnej mikroflóre počas tejto doby sa radikálne zmenil. Pred sto rokmi, veľký Ilya Mechnikova, zakladateľ modernej teórie imunity, pre vytvorenie ktorého on prijal Nobelovu cenu (pre dve osoby s jeho nezmieriteľného súpera, nie menej ako veľký Paul Ehrlich), dokonca navrhoval odstránenie hrubého čreva ako spôsob, ako predĺžiť život. A tých, ktorým toto opatrenie javí ako príliš radikálny, odporúča vypiť veľké množstvo jogurtu vytesniť škodlivý, podľa jeho názoru, mikróby prospešné laktobacily. Za pol storočia sa kurz zmenil o 180 stupňov. Ukázalo sa, že normálnej črevnej mikroflóry, rovnako ako kože a slizníc vykonávať mnoho užitočných funkcií - napríklad potlačiť vitálne funkcie organizmu neustále útočia na patogény. A v posledných rokoch, najodvážnejší z mikrobiológov išli ešte ďalej tým, že vyhlási osobe a jeho symbiotické mikróbov single superorganism.

Vývoj metód molekulárnej biológie viedol vedcov k novej úrovni pochopenia procesov symbiózy človeka a jeho mikroflóry, ktoré sa zdajú byť dobre študované a z ďalšieho štúdia, o ktorom neočakávali zvláštne prekvapenia. Rýchly nárast rýchlosti a zníženia nákladov na metódy sekvenovania DNA (určenie jeho nukleotidovej sekvencie) a paralelný rast osobného počítača a rozvoj internetu umožnili analyzovať informácie o veľkých častiach genómov. Po dešifrovaní chromozómov stoviek druhov jednotlivých baktérií sa objavil nový prístup v genetike mikroorganizmov: populárny prístup: analýza génov všetkých baktérií, ktoré obývali určitú oblasť. Samozrejme, populácia "ľudského bioreaktora" sa ukázala byť jedným z najdôležitejších pre štúdium mikrobiálnej populácie.

Prvá práca, ktorá priniesla úplne nový pohľad na črevnú mikroflóru, vyšla v roku 1999 skupina vedcov z Národného inštitútu pre výskum poľnohospodárstva (Francúzsko) a University of Reading (UK). Autori sa rozhodli použiť metódu sekvenovania 16S RNA génov na štúdium populácie mikrobiálneho čreva (pozri bočný panel).

16S PHK - identifikácia baktérií

Prvou etapou stanovenia mikroorganizmov je ich kultivácia na živných médiách. Ale množstvo mikróbov nechce rásť na žiadnom z médií

Moderné techniky
Študijné skôr nedostupné než kultivovatelných baktérie a začnú ukladať poradie, v úplne mätúce taxonómie už známe prokaryotické bolo možné s rozvojom bioinformatiky a príchodom moderných techník molekulárnej biológie - PCR dovoľuje oblasť DNA, ktorá má prijímať miliardy replík, klonovanie vybraného génu v bakteriálnej plazmidy a sekvenovanie sekvencie metodiky nukleotidy získané v dostatočnom množstve na analýzu. Ideálne marker pre identifikáciu mikroorganizmov ukázali génu kódujúceho 16S ribozomálnej RNA (každé z dvoch ribozomálnej podjednotky - dielne bunkovú proteosyntézu - pozostáva z prekladaných reťazcov molekúl proteínov a ribonukleovej kyseliny).

Perfektný marker
Tento gén je v genóme všetkých známych baktérií a Archaea, ale chýba v eukaryoty a vírusy, a ak sa nájsť jeho charakteristickú sekvenciu nukleotidov, - sú si istí, že čo do činenia s génmi z prokaryot. Tento gén má konzervatívne miesta, rovnaké pre všetky prokaryoty a druhovo špecifické. Konzervatívny výkresy sú pre prvý stupeň polymerázovej reťazovej reakcie - pridanie cieľovej DNA s primermi (osiva DNA úseky, na ktoré študoval Nukleotidová reťazca by sa mali pripojiť k spusteniu analyzovať zvyšok sekvencie) a druhovo špecifických - pre identifikáciu druhu. Stupeň podobnosti druhov špecifických pre jednotlivé druhy odráža vývojové vzťahy rôznych druhov. Na klonovanie a následnú analýzu môže byť použitá samotná ribozomálna RNA, ktorá je v akejkoľvek bunke prítomná vo väčšom množstve ako zodpovedajúci gén. Nukleotidové sekvencie 16S RNA všetkých známych baktérií a archaea sú všeobecne dostupné. Identifikované sekvencie sa porovnávajú s tými, ktoré sa nachádzajú v databázach a identifikujú druhy baktérie alebo deklarujú, že patria k nekultivovaným druhom.

Nová systematika
V poslednej dobe došlo k intenzívnej revízii starých, fenotypových klasifikácií baktérií na základe zle formalizovaných kritérií - od výskytu kolónií po potravinové preferencie a schopnosť farbiť rôznymi farbivami. Nová systematika je založená na molekulárnych kritériách (16S RNA) a iba čiastočne sa opakuje fenotypová.

Čo máme vo vnútri

Kódujúce sekvencie 16S RNA pomocou PCR (PCR) bola vymazaná priamo z "prostredia" - 125 mg človeka, bohužiaľ, stolice bol vložený do E. coli plazmidu (nie preto, že črevné, a pretože Escherichia coli - jeden z obľúbených kolien molekulárnych biológov) a opäť izolovaný od kultúry násobených baktérií. Preto bola vytvorená knižnica 16S RNA génov pre všetky mikroorganizmy vo vzorke. Potom bolo 284 klonov náhodne vybraných a sekvenovaných. Ukázalo sa, že len 24% výsledných 16S RNA sekvencií patrilo k predtým známym mikroorganizmom. Tri štvrtiny mikroflóry sa nachádza v črevách každého človeka, viac ako sto rokov sa vyhnúť pozornosti výskumníkov, vyzbrojený metódami klasickej mikrobiológie! Vedci jednoducho nemohol nájsť podmienky pre pestovanie týchto baktérií, pretože väčšina obyvateľov náladový čriev odmietla vystúpiť na tradičné mikrobiálne prostredie.

K dnešnému dňu, používajúci molekulárnej techniky zistené, že dospelý človek mikroflóry prezentované 10 z 70 hlavných bakteriálnych taxónov. Asi 90% našich mikróbov patrí k typu Firmicutes (sem patrí napríklad slávny laktobacily - hlavné "vinníkov" okysleniu mlieka) a Bacteroidetes - obligátne anaeróbne baktérie (organizmy, ktoré môžu žiť len v neprítomnosti kyslíka), ktoré sú často používané ako ukazovateľ znečistenia prírodné kanalizácie. Zvyšných 10% populácie rozdelené medzi taxónov Proteobacteria (medzi ne patrí, okrem iného, ​​E. coli), Actinobacteria (od jedného z druhov, aktinomycét antibiotickej streptomycín bol izolovaný), Fusobacteria (normálny obyvateľov ústnej dutiny a často spôsobujú periodontitis), verrucomicrobia (v poslednej dobe v geotermálny prameň bol objavený vo forme mikróbov, ktoré sa živia metánom, ktoré oplývajú v čreve kvôli iným mikroorganizmom), sinice (stále sú často označované ako starý - "modro-zelené riasy»), spirochéty (našťastie nd, nie bledý), Synergistes a VadinBE97 (aký druh zvierat, spýtajte sa tvorcovia nové taxonómiu prokaryotes).

Mikrobiálne v nás viac ako ľudské

Pre tento účel, najviac automatizované, počítačové a vysoko výkonné sekvenovanie DNA technológie, dáva možnosť analyzovať krátke nukleotidové sekvencie, zostaviť puzzle niekoľko prekrývajúcich sa "písmená" na koncoch týchto stránok niekoľkokrát opakovať tento postup pre každý kus genómu a prijímať prepisy jednotlivých génov a chromozómov s rýchlosti až 14 miliónov nukleotidov za hodinu - podľa poriadkov rýchlejší ako my len pred niekoľkými rokmi. Tak bolo zistené, že črevná mikroflóra má asi 100000000000000 bakteriálnej bunky - asi desaťkrát väčší ako je celkový počet ľudských buniek v tele.

Súbor génov, ktoré tvoria bakteriálny metagenóm, je približne stokrát väčší ako súbor génov ľudského tela. Ak hovoríme o objeme biochemických reakcií vyskytujúcich sa v mikrobiálnej populácii, opäť opakovane prevyšuje objem biochemických reakcií v ľudskom tele.

Bakteriálna "reaktora" náradie v hostiteľskej metabolického reťazca, ktorý, ktorý nie je schopný sa sám podporovať - ​​napríklad syntéza vitamínov a ich prekurzory, rozklad niektorých toxínov, rozklad celulózy na polysacharidov (u prežúvavcov), atd...

Od detstva až po starobu

Napriek skutočnosti, že druhové zloženie črevných mikroorganizmov je pomerne monotónne, kvantitatívny pomer zástupcov určitých systematických skupín v mikrobiológii rôznych ľudí sa môže veľmi líšiť. Ale čo je normálna črevná mikroflóra a aké sú spôsoby jej vzniku?

Na túto otázku odpovedal v práci skupiny amerických biológov, ktorú viedol Patrick Brown zo Stanfordskej univerzity v roku 2007. V priebehu prvého roka života vysledovali vznik 14 mikróbov u 14 novorodencov. Autori sa podarilo vytvoriť niekoľko zdrojov kolonizácie gastrointestinálneho traktu. Mikroflóra detí bola podobná materským mikroflórom: vaginálne, fekálne alebo mikroflóra materského mlieka. V závislosti od zdrojov kolonizácie v mikroflóre čriev dojčiat počas prvého roka života prevažovali rôzne druhy. Tieto rozdiely zostali počas celej štúdie významné, ale vo veku jedného roka sa prejavili znaky tvorby dospelých mikrobiálnych látok. Zaujímavé údaje boli získané s použitím dvojice dvojčiat. Ich mikroflóra bola prakticky rovnaká v zložení a menila sa rovnakým spôsobom. Toto zistenie odhalilo obrovskú úlohu ľudskej zložky páru "mikrobiota-hostiteľ" pri tvorbe populácie intestinálnej mikroflóry. Za čistotu experimentu, samozrejme, by mal mať oddelené deti stále v nemocnici (Mimochodom, nádherný príbeh o indickom filme! O niekoľko rokov neskôr, dvojčatá spoznať navzájom na analýzu mikroflóry.). Údaje z iných štúdií však potvrdili predpoklad, že individuálne vrátane hereditárne podmienených vlastností ľudskej biochémie majú veľký vplyv na zloženie svojej mikroflóry.

Tenké a hrubé

Štúdie realizované v laboratóriu Jeffrey Gordon (School of Medicine na Washington University, St. Louis, MO), spojí rôznorodosť baktérií tráviaceho traktu s diétou a vlastností konkrétneho metabolizmu. Výsledky experimentu boli zverejnené v decembrovom čísle časopisu príroda za rok 2006. Ročný experiment naznačoval vytvorenie korelácie medzi nadmernou hmotnosťou u človeka a zložením mikrobiálnej populácie jeho čriev. Tucet tukov, ktoré súhlasili s umiestnením brucha na oltár vedy, bolo rozdelené do dvoch skupín. Jedna dedina s nízkym obsahom tuku, druhá s nízkym obsahom sacharidov. Všetky dobrovoľníkov schudol, a zároveň sa zmenili pomer dvoch hlavných skupín črevných mikroorganizmov: počet buniek Firmicutes znížili, zatiaľ čo počet Bacteroidetes, naopak zvyšuje. V prípade diéty s nízkym obsahom tukov sa táto zmena stala pozoruhodnou neskôr - potom, čo pacienti stratili 6% hmotnosti a diétu s nízkym obsahom cukru - po strate prvých kilogramov (2% počiatočnej telesnej hmotnosti). Súčasne bola zmena zloženia mikroflóry ešte výraznejšia, tým menšia bola váha účastníkov experimentu.

Boj s obezitou

Výsledky ďalšieho štúdia vedcov zmeniť myšou symbiotické mikrobiálne organizmus (viď. Box "testovaná na myšiach") brilantne potvrdila hypotézu, že mikroflóra obéznych jedincov zvyšuje hlboké spracovanie potravín. Porovnanie vzoriek DNA stolice obéznych a normálnych myší ukázalo, že myši obéznych myší sú nasýtené enzýmovými génmi, ktoré umožňujú účinnejší rozklad polysacharidov. Črevo obéznych myší obsahovali veľký počet konca fermentačných produktov - zlúčenín octovej a maslovej kyseliny, čo znamená, dôkladnejšie komponenty pre spracovanie potravín. (! Od slova "kalórií") kalorimeter analýzy vzoriek potvrdila, že myšou kreslá: stoličky ob / ob-myší obsahovala menej kalórií ako u myší divokého typu, ktoré neboli úplne zameniteľných energiu z potravy.

Okrem dôležitých informácií o "zárodočné" zložkou autorov obezity boli schopní preukázať podstatnú podobnosť medzi mikroflóry obéznych ľudí a myší, čo otvára nové možnosti pri štúdiu problému nadváhy a prípadne vyriešiť tento problém "prevodu" zdravej mikroflóry alebo jej tvorby u pacientov trpiaci obezitou.

Testované na myšiach

A s vyčerpaním

Skutočnosť, že mikroflóra môže spravovať hostiteľa metabolizmus už nie je pochýb. Výskum laboratória spoločnosti Gordon, venovaný problematike nadmernej hmotnosti, umožnil preniesť most na liečbu metabolických ochorení. Medzi nimi sú také bežné typy vyčerpania, ktoré postihujú deti od jedného do štyroch rokov v chudobných krajinách s tropickým podnebím, ako je marasmus (pre marasmus má toto slovo iba jazykový vzťah: gréčtina. marasmoz doslovne znamená vyčerpanie, vyhynutie) a kwashiorkor (v jazyku jedného z kmeňov Ghany kwashiorkor - "červený chlapec"). Výskyt ochorení spojených s nedostatkom bielkovín a vitamínov v prechode z dojčenia na dospelých potravín. Ale choroba selektívne ovplyvní deti, ktorých bratia a sestry nezaznamenali žiadne problémy s prechodom k tradičnému jedálničku tohto regiónu. Štúdie preukázali, že črevná mikroflóra chorých detí je veľmi odlišný od mikroflóry svojich rodičov, rovnako ako mikroflóry zdravých súrodencov. V prvom rade si všimol takmer úplná absencia črevnej populácií Bacteroidetes a ovládnutie vzácnych druhov, ktoré patria k typom Proteobacteria a Fusobacteria. Po choré deti (pozor, aby sa predávkovanie!) Vykrmovaniu hard-proteín potraviny, ich mikroflóry stáva podobný normálne, ako sú príbuzní, s prevahou Bacteroidetes a Firmicutes.

Nedávne štúdie nielen radikálne zmenila prevládajúce predstavy o ľudskej črevnej mikroflóry, ale tiež prispel k vzniku konceptu, ktorý považuje črevnej mikroflóry ako ďalší multi-bunkové "tela" človeka. Orgán pozostávajúci z rôznych bunkových línií schopných komunikovať medzi sebou, ako aj s hostiteľským organizmom. Orgán, ktorý prerozdeľuje toky energie, vykonáva dôležité fyziologické reakcie, zmeny pod vplyvom životného prostredia a sám sa obnovuje so zmenami spôsobenými vonkajšími podmienkami. Pokračoval výskum "bakteriálna telo" môže a mala by viesť k pochopeniu zákonov jeho fungovanie, zverejňovanie jeho delikátnych vzťahov s hostiteľom a v dôsledku toho, že sa objavujú nové metódy boja proti ľudskej choroby cielenú liečbu dysfunkciou dvoch zložiek metaorganizma.

Analýza 16s RNA

Ribozomálne ribonukleové kyseliny (rRNA) - niekoľko molekúl RNA, ktoré tvoria základ ribozómu. Hlavnou funkciou rRNA je implementácia procesu translácie - čítanie informácií z mRNA adaptáciou molekúl tRNA a katalýza tvorby peptidových väzieb medzi pripojenými aminokyselinami tRNA.

obsah

Ribozomálne podtriedy a nomenklatúra rRNA

Na elektrónové mikroskopické snímky intaktných ribozómov je zrejmé, že pozostávajú z dvoch čiastočiek rôznych veľkostí.

Pomer hmotností čiastočiek je

2: 1; hmota, podľa poradia, vyjadrené v konštánt meraných priamo sedimentácia (rýchlosť usadiť v Svedberg jednotky, S), pri ultratsentrifugovanii, a to je tento parameter bol základom pre názvoslovie rRNA a ribozómov a ribozomálnej podjednotky: použitý typ označenia

Napríklad ribozomálna prokaryotická RNA so sedimentačným koeficientom 16 Svedbergovských jednotiek je označená ako 16S rRNA.

Pretože koeficienty sedimentácie závisia nielen od molekulovej hmotnosti, ale aj od tvaru častíc, sedimentačné koeficienty pre disociáciu nie sú aditívne: napríklad bakteriálne ribozómy s molekulovou hmotnosťou

3 x 10 Dalton má sedimentačný koeficient 70S označený ako 70S a disociuje sa na podjednotky 50S a 30S:

Ribozomálne podtriedy obsahujú jednu molekulu rRNA veľkej dĺžky, ktorej hmotnosť je

2 / 1-3 / 02 s hmotnosťou ribozomálnej podjednotky, teda, v prípade bakteriálneho ribozómu 70S podjednotku obsahuje 50S rRNA 23S (dĺžka

3000 nukleotidov) a podtrieda 30S obsahuje 16S rRNA (dĺžka

1500 nukleotidov); veľké ribozomálnej podjednotky s výnimkou "dlhé" rRNA tiež obsahuje jeden alebo dva "krátke" rRNA (5S rRNA bakteriálna 50S ribozomálnej podjednotky alebo 5S a 5.8S rRNA bolshii eukaryotické ribozomálnej podjednotky).

syntéza

Ribozomálna RNA predstavuje veľkú časť (až 80%) celkovej bunkovej RNA, také množstvo rRNA vyžaduje intenzívnu transkripciu jej kódovacích génov. Táto intenzita je poskytovaná veľkým počtom kópií génov kódujúcich rRNA: v eukaryótoch existuje niekoľko stoviek (

200 kvasiniek) až desiatok tisícov (pre rôzne bavlnené línie 50 - 120 tisíc kópií) génov organizovaných do súborov tandemových opakovaní.

U ľudí sú gény kódujúce rRNA tiež organizované do skupín tandemových opakovaní umiestnených v centrálnych oblastiach chromozómov krátkeho ramena 13, 14, 15, 21 a 22.

Táto zlúčenina bola syntetizovaná RNA polymeráza I vo forme dlhej molekuly vopred ribozomálnu RNA, ktorý je RNA nareže na jednotlivé prostriedky, ktoré sú základom ribozómov. V baktériách a archeochách pôvodný transkript zvyčajne zahŕňa 16S, 23S a 5S rRNA, medzi ktorými sú umiestnené sekvencie pre-rRNA odstránené počas spracovania. Zvyčajne sa medzi gény 16S a 23S rRNA nachádza jeden alebo viac génov tRNA; Preto v E. coli má počiatočný transkript takejto skupiny génov nasledujúcu sekvenciu:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Takýto transkript je rozdelený na fragmenty pre-rRNA a tRNA ribonukleázou III.

V eukaryótoch 18S, 5.8S a 25/28 sú rRNA ko-transkribované RNA polymerázou I, zatiaľ čo 5S rRNA gén je transkribovaný RNA polymerázou III.

V eukaryoty je koncentrácia gény priestor kódujúce rRNA, zvyčajne zreteľne viditeľné v jadre bunky, v dôsledku hromadenia okolo podjednotiek ribozómy, ktoré sú vlastné montáž bezprostredne prebieha. Tieto akumulácie sú dobre zafarbené cytologickými farbivami a sú známe ako jadro. V súlade s tým, že prítomnosť jadierok nie je špecifická pre všetky fázy bunkového cyklu: rozdelenie jadra bunky do Profáza disociuje pretože syntéza a rRNA resuspendované na konci telofázy vytvoreného pri obnovení syntézy rRNA.

Porovnávacia analýza pro- a eukaryotickej rRNA

Ribozomálnu RNA (ako ribozóm) prokaryota a eukaryota líšia od seba navzájom, aj keď vykazujú značné podobnosti sekvencie úsekov. Prokaryotické 70S ribozóm sa skladá z veľkého 50S podjednotku (konštruovaná na základe dvoch molekúl rRNA - 5S a 23S) a 30S malé podjednotky (postavené na základe 16S rRNA). 80S eukaryotických ribozómy sa skladá z veľkého 60S podjednotku (postavené na základe troch molekúl rRNA - 5S, 5,8S a 28S) a 40S malé podjednotky (postavené na základe 18S rRNA).

Používanie informácií o sekvenciách

Informácie o rRNA konkrétneho organizmu sa používajú v medicíne a evolučnej biológii.

  • Gén rRNA je jedným z najkonzervatívnejších (najmenej variabilných) génov. Preto sa systematické postavenie organizmu a čas divergencie s príbuznými druhmi môžu určiť na základe analýzy podobností a rozdielov v sekvenciách rRNA.
  • rRNA je cieľom veľkého množstva antibiotík, z ktorých niektoré sa používajú v klinickej praxi, a to ako pre inhibíciu rastu baktérií (antibiotiká, prokaryotické ribozómu viazanie) a pre liečbu ľudského ochorení (antibiotiká viažu na eukaryotické ribozóm). Do prvej skupiny patria chloramfenikol, erytromycín, kasugamycín, mikrokokksin, spektinomycín, streptomycín, thiostreptonu. K druhému hygromycínu B, paromomycínu.

Súvisiace Články Hepatitída